• El reservori natural d’aquest virus són les vies respiratòries, tant d’animals com dels humans, per tant les mostres que es poden analitzar són fluids biològics del tracte respiratori dels pacients:
  • Vies respiratòries superiors: fluid nasofaringi i fluid bucofaringi.
  • Vies respiratòries inferiors: esput (si és possible), rentat bronco-alveolar i aspirat endotraqueal, especialment en pacients amb malaltia respiratòria greu.
• Altres tipologies de mostres són sang, sèrum o plasma, i també s’ha detectat el virus en femta. Donat que la transmissió del virus és aèria, els requeriments per la presa de mostra inclouen fer ús dels equips de protecció individual (EPIs) adequats per evitar el contagi entre el pacient i el professional, ja que en la presa de mostra hi ha un alt risc d’exposició a aerosols.

• L’anàlisi del SARS-COV-2 es pot fer per diferents tècniques analítiques: PCR (Polimerase Chain Reaction), ELISA (Enzyme-Linked Immuno- Sorbent Assay) o per la tècnica d’immunocromatografia, els anomenats tests ràpids. També es pot analitzar per seqüenciació (per monitorar les mutacions del genoma viral o realitzar estudis d’epidemiologia molecular), o fer cultiu del virus (per estudis d’investigació), tot i que no es recomana l’aïllament del virus per l’anàlisi diagnòstic.
• La tècnica de detecció més complexa és la PCR, que pertany al grup de tècniques basades en la biologia molecular i requereix disposar d’un laboratori especialitzat, amb condicions i instrumentació adequades, així com de reactius específics. És el mètode de referència i el recomanat per l’Organització Mundial de la Salut (OMS). Un dels requeriments importants és que abans d’analitzar la mostra cal inactivar el virus mitjançant l’ús d’enzims com la proteïnasa, o de tampons de lisi que continguin isotiocianat de guanidina a concentracions adequades.
• La tècnica d’immunocromatografia és la base dels tests ràpids. Les mostres que s’analitzen amb aquests tests són de sang, plasma, sèrum o fluid nasofaringi/bucofaringi. Són tests d’anticossos o d’antígens; els primers poden detectar els 2 tipus d’anticòs que generen els humans en presència de virus: anticossos IgM (o anticossos “immediats”, generats en els primers estadis de la infecció) i anticossos IgG (o anticossos “de memòria”, especialitzats i capaços de reconèixer patògens amb els quals el cos ja ha estat en contacte). El resultat és de lectura visual, cal veure si apareixen línies de color corresponents als diferents tipus d’anticossos.
• Existeixen tests ràpids basats en la detecció d’antígens, és a dir en la presència del virus en el tracte respiratori del pacient. Aquests tests han millorat molt la seva sensibilitat per detectar la infecció en els seus estadis primigenis, on hi ha una elevada replicació del virus.
• La tècnica ELISA requereix mostra de sang i també es basa en la detecció dels anticossos generats pel pacient. Per dur-la a terme cal, però, tractar la mostra en el laboratori i tenir l’equipament necessari. Aquest és, bàsicament, un lector colorimètric que detecta la resposta de cromòfors específics linkats a la unió antigen-anticòs.

Cal dir que no hi ha una tècnica que sigui la solució definitiva a la problemàtica de l’anàlisi del SARS-COV-2. Totes les tècniques tenen avantatges i inconvenients.

• PCR
  • Avantatges: la fiabilitat dels seus resultats (és més sensible i específica que els altres mètodes) i poder detectar els estats inicials de la infecció (entre els dies 1-14, quan el pacient no mostra símptomes). També permet estudiar un gran nombre de casos per la possible automatització dels procediments.
  • Inconvenients: la necessitat de disposar de laboratori equipat, personal format i la lentitud dels resultats (unes 6 hores com a mínim). A més, aquesta tècnica pot donar resposta positiva en cas de presència de restes de virus no funcionals, el que s’anomena “fals positiu”.
• Tests ràpids serològics, basats en la immunocromatografia
  • Avantatges: la rapidesa dels resultats (aproximadament de 10 a 15 minuts), la senzillesa de la manipulació i que no requereix personal especialitzat.
  • Inconvenients: la menor sensibilitat i especificitat (capacitat de diferenciar el SARS-CoV2 d’altres virus, com el MERS coronavirus), en comparació amb la PCR, és a dir, la possibilitat d’obtenir falsos negatius, ja que els humans tarden uns 6 dies de mitjana a desenvolupar anticossos; per tant, en el període de temps entre la infecció i el desenvolupament d’anticossos el test pot rendir un resultat negatiu i ser fals. Es tracta, per tant de proves indirectes, ja que no detecten el virus sinó la reacció del pacient al virus.
• Tests ràpids d’antígens, basats en immunocromatografia:
  • Avantatges: la rapidesa dels resultats, la senzillesa de la seva manipulació i la possibilitat d’ús per personal no especialitzat. La seva sensibilitat comparada amb la tècnica PCR en mostres de les vies respiratòries superiors, pot ser superior al 93% per alguns dels kits comercialitzats en l’actualitat i la seva especificitat és superior al 97%. Aquests tests són útils per detectar pacients en la fase presimptomàtica (d’1 a 3 dies abans de l’aparició de símptomes), tot i que el seu període de resposta òptim està entorn dels primers 5 a 7 dies després que el pacient mostri símptomes, quan la càrrega viral és màxima, i per tant, el pacient està en el punt màxim de la seva capacitat infectiva. Es tracta, per tant de proves directes, ja que detecten les proteïnes del virus.
  • Inconvenients: no substitueixen la PCR, ja que aquesta última amplifica l’ARN del virus, i, per tant és capaç de detectar càrregues virals molt baixes. A més, la sensibilitat d’aquests tests decau a partir del 7è dia després que el pacient mostri símptomes, donat que la càrrega viral comença a disminuir.
• ELISA
  • Avantatges: el fet que en detectar anticossos, donen informació sobre l’estat immunitari del pacient, és a dir, si el pacient ja ha superat la infecció.
  • Inconvenients: poden donar resultats falsos negatius en el període que va des de la infecció al desenvolupament dels símptomes per part del pacient. A més, requereixen disposar d’una mínima instrumentació de laboratori i tarden un parell d’hores en aconseguir el resultat.

• Hi ha diferents tipus de PCR, entre elles la convencional i la Real Time-PCR (QRT-PCR). La primera és una tècnica no quantitativa, mentre que la segona ho pot ser. La QRT-PCR amplifica parts molt específiques de l’ADN, donant finalment una resposta fluorescent que permet obtenir resultats quantitatius.
• Els gens diana per a la detecció del SARS-CoV-2 inclouen fins ara, els gens N, E, S i RdRP.
• D’altra banda, cal tenir en compte que el virus SARS-CoV-2 no té ADN sinó ARN, i per tant cal fer la transformació prèvia d’un en l‘altre usant un enzim específic, la transcriptasa reversa. La reacció de la RT-PCR es duu a terme en un equip anomenat termociclador, en el que es realitzen molts cicles d’escalfament i refredament afavorint la desnaturalització de l’ADN i permetent que els “primers” s’uneixin a la regió d’ADN diana. Aleshores, l’enzim DNA polimerasa utilitza els “primers” amb sondes fluorescents, per elongar la cadena d’ADN afegint oligonucleòtids, generant així còpies d’ADN diana i originant una emissió de fluorescència, que és el que mesura el detector.
• Un augment de resposta (emissió fluorescent) en el temps significa un resultat positiu, és a dir, presència de material genètic del virus en la mostra, mentre que si no s’observa augment de fluorescència, implica que el virus és absent en la mostra.

• La tècnica PCR té una elevada fiabilitat i és la tècnica de referència per confirmar resultats de proves prèvies (amb simptomatologia compatible o resultat positiu de tests ràpids). La fiabilitat és superior al 90% (és a dir, el marge d’error és inferior al 10%)
• La tècnica PCR detecta ADN, però no solament l’actiu, sinó que també en detecta fragments o fins i tot ADN “mort”, que correspon a bacteris o virus ja inactius; per tant és una tècnica que pot donar lloc a resultats “falsos positius”, és a dir pot ser que un pacient que tingui el virus inactiu doni positiu a PCR. El resultat de la PCR és una “fotografia” del moment en què s’ha pres la mostra.
• Un resultat positiu pot marcar estadis diferents de l’evolució de la malaltia en el pacient:
  • Pacient infectat recentment, sense símptomes (habitualment entre els dies 1 i 14 després de la infecció)
  • Pacient infectat i amb símptomes.
• Un resultat negatiu marca que el pacient no ha estat infectat pel virus o bé que ha estat infectat i ha superat la infecció; no distingeix aquests dos casos. Cal tenir en compte que la PCR també pot donar falsos negatius per una presa inadequada de la mostra o un retard en el seu transport al laboratori.
• D’altra banda, la PCR també pot presentar inhibicions per les característiques de la mostra, és a dir, poden haver-hi mostres amb components que inhibeixin la resposta fluorescent. En aquest cas s’hauria de repetir l’anàlisi per tal d’obtenir un resultat. Davant de qualsevol dubte d’interpretació dels resultats cal contactar amb el laboratori.

• Hi ha dos tipus de tests ràpids, anomenats així, perquè el resultat s’obté en uns 10-15 minuts: els que detecten els anticossos (o immuno-globulines que generen els pacients) i els que detecten els antígens, proteïnes característiques del SARS-CoV-2. Els tests d’anticossos poden detectar els 2 tipus d’anticòs que generen els humans en presència de virus: anticossos o immunoglobulines IgM (les que el cos genera en els primers estadis de la infecció) i les IgG, o anticossos capaços de reconèixer infeccions anteriors. Les IgM i les IgG es generen a partir de la primera setmana després que el pacient mostri símptomes i solen tenir el seu màxim entre la 2a i la 3a setmana després de l’aparició d’aquests símptomes.
• El test consisteix a fer una punxada en un dit per obtenir una gota de sang, que es diposita en el cassette del test; alguns tests requereixen que s’addicioni una gota de tampó fosfat, altres no. Un cop fet això, cal esperar la migració dels anticossos al llarg del test (uns 15 minuts) i l’aparició de bandes de color que indiquen els possibles resultats.

• Un cop fet el test es poden obtenir diferents resultats, segons les bandes que s’observin. Cal dir que tots aquests tests incorporen una banda “control” per assegurar que tot s’ha fet correctament. Si el test és del tipus més complet, dels que permet diferenciar les immuno-globulines, els possibles resultats són els següents:
  • Banda acolorida a IgM i a control positiu: El pacient ha estat infectat fa uns dies i ha desenvolupat anticossos immediats. Pot ser que no mostri símptomes aparents.
  • Banda acolorida a IgG, a IgM i a control positiu: El pacient ja fa més dies que pateix la infecció i comença a mostrar símptomes, a la vegada que desenvolupa les immunoglobulines de memòria.
  • Banda acolorida a IgG i a control positiu: El pacient ja ha superat la malaltia i té anticossos per superar una propera infecció. Aquest és un resultat interessant, ja que permet observar quina part de la població s’ha immunitzat contra el virus i s’ha preparat per a una possible nova infecció.
  • Bandes acolorides a IgG i IgM però sense color a la banda de control: test invàlid; alguna de les condicions inicials no s’ha complert.
• Una de les diferències principals entre els tests serològics que distingeixen les immunoglobulines IgG/IgM i la PCR és que aquests tests permeten detectar quina part de la població s’ha immunitzat al virus. Per tant, són molt útils per a l’estudi epidemiològic de la malaltia i per detectar aquells casos que no s’han pogut identificar per la cerca activa de casos. També són importants en el suport del desenvolupament de vacunes.
• D’altra banda, hi ha tests serològics al mercat que no permeten distingir les línies de les dues immunoglobulines, de forma que no és possible saber si el pacient ja ha superat la infecció.
• En la interpretació dels tests de detecció d’anticossos s’han de tenir en compte diversos factors com ara:
  • En la força de la resposta d’anticossos intervenen diversos factors com ara l’edat, l’estat nutricional, la severitat de la malaltia i certes medicacions o infeccions que suprimeixen el sistema immune (com VIH).
  • Un diagnòstic basat només en la resposta a anticossos sovint només es podria donar en la fase de recuperació de la malaltia, quan la majoria de les oportunitats d’intervenció clínica i interrupció de la malaltia ja haurien passat.
  • Hi ha discussió sobre si la presència d’anticossos prediu la immunitat a la reinfecció per SARS-CoV-2, no hi ha evidències fins ara.

• El funcionament és similar als tests d’anticossos en el sentit que donen resultats en 15 minuts i són interpretables visualment, sense necessitat d’aparells de laboratori.
• Aquests tests detecten la presència de proteïnes virals (antígens), és a dir, detecta la presència del virus quan s’uneix a uns anticossos del SARS-CoV-2 fixats en una tira reactiva; per tant no pateixen el decalatge de temps entre la infecció i la generació d’anticossos per part del pacient. És a dir, detecten el virus i no els anticossos generats pel pacient, com en el cas dels tests serològics usats fins ara. Això implica que es poden detectar pacients infectats abans que amb els tests d’anticossos, ja que amb aquests últims cal esperar que el pacient tingui reacció immunitària (generi anticossos). Això pot ser un gran avantatge, així i tot, hi ha alguns inconvenients que cal esmentar:
  • La seva sensibilitat decau a partir del 7è dia des de l’aparició de símptomes.
  • No arriben a la sensibilitat de la prova PCR, ja que aquesta amplifica l’ARN del virus i per tant, pot detectar càrregues virals menors.

• Un cop fet el test es poden obtenir diferents resultats, segons les bandes que s’observin. Cal dir que aquests tests incorporen una banda “control” per assegurar que tot s’ha fet correctament. Els possibles resultats són els següents:
  • Banda acolorida a test i a control positiu: El pacient ha estat infectat i el virus s’ha multiplicat. Pot ser que mostri símptomes o que no en mostri (per ser asimptomàtic).
  • Banda acolorida a test però sense color a la banda control: test invàlid; alguna de les condicions inicials no s’ha complert.
  • Banda acolorida a control positiu i no a test: El test no està detectant les proteïnes del virus. Pot ser que el pacient no s’hagi infectat, però cal tenir en compte que un resultat negatiu de test d’antigen no pot excloure completament una infecció activa per SARS-CoV-2 i, per tant, s’hauria de repetir la prova o, preferiblement, realitzar proves de confirmació per RT-PCR sempre que sigui possible, particularment en pacients simptomàtics.
• Una de les diferències principals entre aquests tests i els tests serològics d’anticossos que distingeixen les immunoglobulines IgG/IgM, és que aquests tests no permeten detectar quina part de la població s’ha immunitzat al virus, mentre que els segons sí ho permeten.
• En la interpretació s’ha de tenir en compte que el funcionament del test depèn de diferents factors, com ara el temps d’aparició de la malaltia, la concentració del virus en la mostra, la qualitat de la mostra recollida i el seu tractament, així com la formulació dels reactius del kit i la seva sensibilitat.

• A part dels tests serològics, al mercat hi ha kits ELISA. La base d’un test ELISA és també la detecció dels anticossos generats pel cos en contacte amb virus. Els Kits ELISA en el mercat poden detectar les immuno-globulines IgG i IgM per separat.
• Els tests ELISA requereixen treballar en un laboratori, ja que cal disposar d’instrumentació, com ara rentador de plaques i lector ELISA, que és, bàsicament, un espectrofotòmetre. Hi ha diferents tipus de tests ELISA, directes, indirectes, sandwich, competitiu, etc.
• La base del funcionament d’aquests tipus de test és la reacció antigen-anticòs, com en els tests serològics; els antígens són fixats en els pouets del test, seguidament se sembren les mostres de sèrum a analitzar i després d’un temps de reacció, s’afegeix un cromòfor específic que es lliga a la unió antigen-anticòs obtinguda en el pas anterior; d’aquesta manera s’obté una resposta acolorida que es pot mesurar en un espectrofotòmetre.

• Els kits ELISA són molt específics i de fet poden usar-se per detectar les IgG o les IgM. Si s’ha usat un test que detecta IgM, sabrem si el pacient es troba en l’estat inicial de la infecció. Si s’ha usat un test que detecta les IgG, sabrem si el pacient està immunitzat.
• Hi ha la possibilitat d’obtenir resultats falsos negatius en el període inicial de la infecció, si el pacient no ha desenvolupat suficients anticossos.

• Les característiques del virus SARS-CoV-2, amb alta capacitat de transmissió i un període latent de 6 a 14 dies per donar símptomes apreciables, fa que sigui un patogen de difícil manipulació.
• Conforme la recent Directiva (UE): 2020/739 de la Comissió, de 3 de juny de 2020, SARS-CoV-2 és classificat com a Agent Biològic de nivell 3. Tot i això, s’especifica que el treball no propagatiu dels laboratoris de diagnòstic amb SARS-CoV-2 ha d’efectuar-se en una instal·lació que utilitzi procediments equivalents al nivell 2 de contenció, com a mínim. El treball propagatiu amb SARS-CoV-2 s’ha de dur a terme en un laboratori de nivell 3 de contenció, amb pressió negativa respecte a la pressió atmosfèrica.
• A part de la presa de mostra, el transport de les mateixes i la seva manipulació dins del laboratori ha de fer-se garantint la seguretat del personal, motiu pel qual es requereix l’ús d’EPIs de nivell adequat al risc biològic.

Projecte Convat:

• Liderat per l’Institut Català de Nanociència i Nanotecnologia (ICN2) en col·laboració amb UB, Universitat Aix-Marsella (AMU) de França i l’Institut Nacional de Malalties Infeccioses (INMI) d’Itàlia.
• Consisteix a desenvolupar una plataforma biosensora basada en nanotecnologia òptica pel diagnòstic de la Covid-19 sense necessitat de disposar de laboratori ni de grans instruments.
• Detecta i quantifica les molècules (ARN viral) o el virus sencer sense necessitat d’amplificar

COVID-19 Sounds App:

• Liderat per la Universitat de Cambridge.
• Consisteix a desenvolupar una aplicació capaç de detectar de manera precoç la COVID-19 a través d’algoritmes d’aprenentatge automàtic, basat en sons de la veu, de respiració i de tos.
• Els resultats mostren que la combinació de respiració i tos poden predir la COVID-19 amb gairebé un 80 % d’exactitud.

Al web de la Comissió Europea podeu trobar un llistat de tots els projectes finançats per a la lluita contra la COVID-19:

• COVID-19 In Vitro Diagnostic Devices and Test Methods Database

Podeu trobar informació al Canal Salut de la Generalitat de Catalunya:

• Poves de detecció