• El reservorio natural de estos virus son las vías respiratorias, tanto de animales como de humanos, por tanto, las muestras que se pueden analizar son fluidos biológicos del tracto respiratorio de los pacientes.
  • Vías respiratorias superiores: fluido nasofaríngeo y fluido bucofaríngeo
  • Vías respiratorias inferiores: esputo (si es posible), lavado bronco-alveolar y aspirado endotraqueal, especialmente en pacientes con enfermedad respiratoria grave.
• Otras tipologías de muestra son sangre, suero o plasma, y también se ha detectado el virus en heces. Dado que la transmisión del virus es aérea, los requerimientos para la toma de muestra incluyen hacer uso de los equipos de protección individual (EPIs) adecuados para evitar el contagio entre el paciente y el profesional, ya que en la toma de muestra existe un riesgo alto de exposición a aerosoles.

• El análisis del SARS-COV-2 se puede hacer por diferentes técnicas analíticas: PCR (Polimerase Chain Reaction), ELISA (Enzyme-Linked Immuno- Sorbent Assay) o por la técnica de immunocromatografía, las llamadas pruebas rápidas. También se puede analizar por secuenciación (para monitorizar las mutaciones del genoma viral o realizar estudios de epidemiología molecular), o hacer cultivo de virus (para estudios de investigación), aunque no se recomienda el aislamiento del virus por el análisis diagnóstico.
• La técnica de detección más compleja es la PCR, que pertenece al grupo de técnicas basadas en la biología molecular y requiere disponer de un laboratorio especializado, con condiciones e instrumentación adecuadas, así como de reactivos específicos. Es el método de referencia y el recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Uno de los requerimientos más importantes antes de analizar la muestra consiste en inactivar el virus mediante el uso de enzimas como la proteinasa, o de tampones de lisis que contengan isotiocianato de guanidina en concentraciones adecuadas.
• La técnica de inmunocromatografía es la base de los test rápidos, las muestras que se analizan con éstos son de sangre, de plasma, suero o fluido nasofaríngeo/bucofaríngeo. Son test de anticuerpos o antígenos; los primeros pueden detectar los 2 tipos de anticuerpo que generan los humanos en presencia de virus: anticuerpos igM (o anticuerpos “inmediatos”, generados en los primeros estadios de la infección) y anticuerpos IgG (O anticuerpos “de memoria”, especializados y capaces de reconocer patógenos con los que el cuerpo ya ha estado en contacto). El resultado es de lectura visual, requiere visualizar si aparecen líneas de color correspondientes a los diferentes tipos de anticuerpo
• Existen test rápidos basados en la detección de antígenos, es decir en la presencia del virus en el tracto respiratorio del paciente. Estas pruebas han mejorado mucho su sensibilidad para detectar la infección en sus estadios iniciales, en los que existe una replicación del virus elevada.
• La técnica ELISA requiere muestra de sangre y también se basa en la detección de los anticuerpos generados por el paciente. Para llevarla a cabo se debe, pero, tratar la muestra en el laboratorio y tener el equipamiento necesario. Este es, básicamente, un lector colorimétrico que detecta la respuesta de cromóforos específicos linkados a la unión antígeno – anticuerpo.

No existe una técnica que sea la solución definitiva a la problemática del análisis del SARS-COV-2. Todas las técnicas tienen ventajas e inconvenientes.

• PCR
  • Ventajas: la fiabilidad de sus resultados (es más sensible y específica que otros métodos) y poder detectar los estados iniciales de la infección (entre los días 1-14, cuando el paciente no muestra síntomas). También permite estudiar un gran número de casos por la posible automatización de los procedimientos
  • Inconvenientes: la necesidad de disponer de laboratorio equipado, personal formado y la lentitud de los resultados (Unas 6 horas como mínimo). Además, esta técnica puede dar respuesta positiva en caso de presencia de restos de virus no funcionales, lo que se llama “falso positivo”.
• Pruebas rápidas serológicas, basadas en la inmunocromatografía
  • Ventajas: rapidez en los resultados (aproximadamente de 10 a 15 minutos), la sencillez de la manipulación y que no requiere personal especializado.
  • Inconvenientes: menor sensibilidad y especificidad (capacidad de diferenciar el SARS-CoV2 de otros virus, como el MERS coronavirus), en comparación con la PCR, es decir, la posibilidad de obtener falsos negativos, ya que los humanos tardan 6 días de promedio en desarrollar anticuerpos la prueba puede rendir un resultado negativo y ser falso. Se trata, por tanto, de pruebas indirectas, ya que no detectan el virus sino la reacción del paciente al virus.
• Pruebas rápidas de antígenos, basadas en la inmunocromatografía:
  • Ventajas: la rapidez de los resultados, la sencillez de su manipulación y la posibilidad de uso por parte de personal no especializado. Su sensibilidad comparada con la técnica PCR en muestras de las vías respiratorias superiores, puede ser superior al 93% para algunos de los kits comercializados en la actualidad y su especificidad es superior al 97%. Estas pruebas son útiles para detectar pacientes en la fase presintomática (de 1 a 3 días antes de la aparición de síntomas), aunque su período de respuesta óptima está alrededor de los primeros 5 a 7 días después de que el paciente muestre síntomas, cuando la carga viral es máxima, y, por tanto, el paciente está en el punto máximo de su capacidad infectiva. Se trata, por tanto, de pruebas directas, ya que detectan las proteínas del virus.
  • Inconvenients: no substitueixen la PCR, ja que aquesta última amplifica l’ARN del virus, i, per tant és capaç de detectar càrregues virals molt baixes. A més, la sensibilitat d’aquests tests decau a partir del 7è dia després que el pacient mostri símptomes, donat que la càrrega viral comença a disminuir.
• ELISA
  • Ventajas: el hecho que al detectar anticuerpos, den información sobre el estado inmunitario del paciente, es decir, si el paciente ya ha superado la infección.
  • Inconvenientes: pueden dar resultados falsos negativos en el periodo que va des de la infección al desarrollo de los síntomas por parte del paciente. Además, requieren disponer de una mínima instrumentación de laboratorio i tardan un par de horas en conseguir el resultado.

• Existen diferentes tipos de PCR, entre ellas la convencional y la Real Time-PCR (QRT-PCR). La primera es una técnica no cuantitativa, mientras que la segunda lo puede ser. La QRT-PCR amplifica partes muy específicas del ADN, dando finalmente una respuesta fluorescente que permite obtener resultados cuantitativos.
• Los genes diana para la detección del SARS-CoV-2 incluyen hasta el momento, los genes N, E, S i RdRP.
• Por otra parte, hay que tener en cuenta que el virus SARS-CoV-2 no tiene ADN sino ARN, y, por tanto, hay que hacer la transformación previa de uno en el otro usando una enzima específica, la transcriptasa reversa. La reacción de la RT-PCR se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador, en el que se realizan muchos ciclos de calentamiento y enfriamiento favoreciendo la desnaturalización del ADN y permitiendo que los “primeros” se unan a la región del ADN diana. Entonces, la enzima DNA polimerasa utiliza los “primeros” con sondas fluorescentes para elongar la cadena de ADN añadiendo oligonucleótidos, generando así copias de ADN diana y originando una emisión de fluorescencia, que es la que mide el detector.
• Un aumento de respuesta (emisión fluorescente) en el tempo significa un resultado positivo, es decir, presencia de material genético del virus en la muestra, mientras que, si no se observa aumento de fluorescencia, implica que el virus está absente en la muestra.

• La técnica PCR tiene una elevada fiabilidad y es la técnica de referencia para confirmar resultados de pruebas previas (con sintomatología compatible o resultado positivo de pruebas rápidas). La fiabilidad es superior al 90% (es decir, el margen de error es inferior al 10%)
• La técnica PCR detecta ADN, pero no solamente el activo, sino que también detecta fragmentos o incluso ADN “muerto”, que corresponde a bacterias o virus ya inactivos; por tanto, es una técnica que puede dar lugar a resultados “falsos positivos”, es decir, puede ser que un paciente que tenga el virus inactivo de positivo en la PCR. El resultado de la PCR es una “fotografía” del momento en que se ha tomado la muestra.
• Un resultado positivo puede marcar estadios diferentes de la evolución de la enfermedad en el paciente:
  • Paciente infectado recientemente, sin síntomas (habitualmente entre los días 1 i 14 después de la infección)
  • Paciente infectado y con síntomas.
• Un resultado negativo marca que el paciente no ha sido infectado por el virus o bien que ha sido infectado y ha superado la infección; no distingue estos dos casos. Hay que tener en cuenta que la PCR también puede dar falsos negativos por una toma inadecuada de la muestra o un retraso en su transporte al laboratorio.
• Por otra parte, la PCR también puede presentar inhibiciones por las características de la muestra, es decir, puede haber muestras con componentes que inhiban la respuesta fluorescente. En este caso debería repetir el análisis para obtener un resultado. Ante cualquier duda de interpretación de los resultados hay que contactar con el laboratorio.

• Hay dos tipos de tests rápidos, llamados así, porque el resultado se obtiene en unos 10-15 minutos: los que detectan los anticuerpos (o inmuno-globulinas que generan los pacientes) y los que detectan los antígenos, proteínas características del SARS-CoV-2. Los tests de anticuerpos pueden detectar los 2 tipos de anticuerpo que generan los humanos en presencia de virus: anticuerpos o inmunoglobulinas IgM (las que el cuerpo genera en los primeros estadios de la infección) y las IgG, o anticuerpos capaces de reconocer infecciones anteriores. Las IgM y IgG se generan a partir de la primera semana después de que el paciente muestre síntomas y suelen tener su máximo entre la 2ª y la 3ª semana después de la aparición de estos síntomas.
• El test consiste en hacer un pinchazo en un dedo para obtener una gota de sangre, que se deposita en el cassette del test; algunos tests requieren que se adicione una gota de tampón fosfato, otros no. Una vez hecho esto, hay que esperar la migración de los anticuerpos a lo largo del test (unos 15 minutos) y la aparición de bandas de color que indican los posibles resultados.

• Una vez hecho el test se pueden obtener diferentes resultados, según las bandas que se observen. Hay que decir que todos estos tests incorporan una banda «control» para asegurar que todo se ha hecho correctamente. Si el test es del tipo más completo, de los que permite diferenciar las inmuno-globulinas, los posibles resultados son los siguientes:
  • Banda coloreada a IgM y control positivo: El paciente ha sido infectado hace unos días y ha desarrollado anticuerpos inmediatos. Puede que no muestre síntomas aparentes.
  • Banda coloreada a IgG, a IgM y a control positivo: El paciente hace más días que sufre la infección y comienza a mostrar síntomas, a la vez que desarrolla las inmunoglobulinas de memoria.
  • Banda coloreada a IgG y a control positivo: El paciente ya ha superado la enfermedad y tiene anticuerpos para superar una próxima infección. Este es un resultado interesante, ya que permite observar qué parte de la población se ha inmunizado contra el virus y se ha preparado para una posible nueva infección.
  • Bandas coloreadas a IgG e IgM pero sin color en la banda de control: test inválido; alguna de las condiciones iniciales no se ha cumplido.
• Una de las diferencias principales entre los tests serológicos que distinguen las inmunoglobulinas IgG / IgM y la PCR es que estos tests permiten detectar qué parte de la población se ha inmunizado al virus. Por lo tanto, son muy útiles para el estudio epidemiológico de la enfermedad y para detectar aquellos casos que no se han podido identificar por la búsqueda activa de casos. También son importantes en el apoyo del desarrollo de vacunas.
• Por otra parte, hay tests serológicos en el mercado que no permiten distinguir las líneas de las dos inmunoglobulinas, de forma que no es posible saber si el paciente ya ha superado la infección.
• En la interpretación de los tests de detección de anticuerpos se deben tener en cuenta diversos factores como:
  • En la fuerza de la respuesta de anticuerpos intervienen varios factores como la edad, el estado nutricional, la severidad de la enfermedad y ciertas medicaciones o infecciones que suprimen el sistema inmune (como VIH).
  • Un diagnóstico basado sólo en la respuesta a anticuerpos continuado sólo se podría dar en la fase de recuperación de la enfermedad, cuando la mayoría de las oportunidades de intervención clínica e interrupción de la enfermedad ya habrían pasado.
  • Hay discusión sobre si la presencia de anticuerpos predice la inmunidad a la reinfección por SARS-CoV-2. Hasta el momento, no existen evidencias.

• El funcionamiento es similar a los tests de anticuerpos en el sentido que dan resultados en 15 minutos y son interpretables visualmente, sin necesidad de aparatos de laboratorio.
• Estos tests detectan la presencia de proteínas virales (antígenos), es decir, detecta la presencia del virus cuando se une a unos anticuerpos del SARS-CoV-2 fijados en una tira reactiva; por tanto no sufren el decalaje de tiempo entre la infección y la generación de anticuerpos por parte del paciente. Es decir, detectan el virus y no los anticuerpos generados por el paciente, como en el caso de los tests serológicos usados hasta ahora. Esto implica que se pueden detectar pacientes infectados antes que con los tests de anticuerpos, ya que con estos últimos hay que esperar que el paciente tenga reacción inmunitaria (genere anticuerpos). Esto puede ser una gran ventaja. Con todo, hay algunos inconvenientes que cabe mencionar:
  • Su sensibilidad decae a partir del 7.º día desde la aparición de síntomas.
  • No alcanzan a la sensibilidad de la prueba PCR, ya que ésta amplifica el ARN del virus y por tanto, puede detectar cargas virales menores.

• Una vez realizado el test se pueden obtener diferentes resultados, según las bandas que se observen. Hay que decir que estos tests incorporan una banda «control» para asegurar que todo se ha llevado a cabo correctamente. Los posibles resultados son los siguientes:
  • Banda coloreada a test y control positivo: El paciente ha sido infectado y el virus se ha multiplicado. Puede que muestre síntomas o que no muestre (por ser asintomático).
  • Banda coloreada a test pero sin color en la banda control: test inválido; alguna de las condiciones iniciales no se ha cumplido.
  • Banda coloreada a control positivo y no a test: El test no está detectando las proteínas del virus. Puede ser que el paciente no se haya infectado, pero hay que tener en cuenta que un resultado negativo de test de antígeno no puede excluir completamente una infección activa por SARS-CoV-2 y, por lo tanto, se tendría que repetir la prueba o, preferiblemente, realizar pruebas de confirmación por RT-*PCR siempre que sea posible, particularmente en pacientes sintomáticos.
• Una de las diferencias principales entre estos tests y los tests serológicos de anticuerpos que distinguen las inmunoglobulinas IgG / IgM, es que estos tests no permiten detectar qué parte de la población se ha inmunizado al virus, mientras que los segundos sí lo permiten.
• En la interpretación se debe tener en cuenta que el funcionamiento del test depende de diferentes factores, como el tiempo de aparición de la enfermedad, la concentración del virus en la muestra, la calidad de la muestra recogida y su tratamiento, así como la formulación de los reactivos del kit y su sensibilidad.

• A parte de los tests serológicos, en el mercado hay kits ELISA. La base de un test ELISA es también la detección de los anticuerpos generados por el cuerpo en contacto con virus. Los Kits ELISA en el mercado pueden detectar las inmuno-globulinas IgG e IgM por separado.
• Los tests ELISA requieren trabajar en un laboratorio, ya que es necesario disponer de instrumentación, como lavador de placas y lector ELISA, que es, básicamente, un espectrofotómetro. Hay diferentes tipos de tests ELISA, directos, indirectos, sandwich, competitivo, etc.
• La base del funcionamiento de este tipo de test es la reacción antígeno-anticuerpo, como en los tests serológicos; los antígenos son fijados en las pocetas del test, seguidamente se siembran las muestras de suero a analizar y después de un tiempo de reacción, se añade un cromóforo específico que se liga a la unión antígeno-anticuerpo obtenida en el paso anterior; de este modo se obtiene una respuesta coloreada que se puede medir en un espectrofotómetro.

• Los kits ELISA son muy específicos y de hecho pueden usarse para detectar las IgG o las IgM. Si se ha usado un test que detecta IgM, sabremos si el paciente se encuentra en el estado inicial de la infección. Si se ha usado un test que detecta las IgG, sabremos si el paciente está inmunizado.
• Existe la posibilidad de obtener resultados falsos negativos en el periodo inicial de la infección, si el paciente no ha desarrollado suficientes anticuerpos.

• Las características del virus SARS-CoV-2, con alta capacidad de transmisión y un período latente de 6 a 14 días para dar síntomas apreciables, hace que sea un patógeno de difícil manipulación.
• Conforme la reciente Directiva (UE): 2020/739 de la Comisión, de 3 de junio de 2020, SARS-CoV-2 es clasificado como Agente Biológico de nivel 3. Aun así, se especifica que el trabajo no propagativo de los laboratorios de diagnóstico con SARS-CoV-2 tiene que efectuarse en una instalación que utilice procedimientos equivalentes al nivel 2 de contención, como mínimo. El trabajo propagativo con SARS-CoV-2 se tiene que llevar a cabo en un laboratorio de nivel 3 de contención, con presión negativa respecto a la presión atmosférica.
• Aparte de la toma de muestra, el transporte de las mismas y su manipulación dentro del laboratorio debe hacerse garantizando la seguridad del personal, por lo que se requiere el uso de EPIs de nivel adecuado al riesgo biológico.

Proyecto Convat:

• Liderado por el Instituto Catalán de Nanociencia y Nanotecnología (ICN2) en colaboración con UB, Universidad Aix-Marsella (AMU) de Francia y el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (inmi) de Italia.
• Consiste en desarrollar una plataforma biosensora basada en nanotecnología óptica para el diagnóstico de la Covid-19 sin necesidad de disponer de laboratorio ni de grandes instrumentos.
  Detecta y cuantifica las moléculas (ARN viral) o el virus entero sin necesidad de amplificar.

COVID-19 Sounds App:

• Liderado por la Universidad de Cambridge.
• Consiste en desarrollar una aplicación capaz de detectar de forma precoz la Covid-19 a través de algoritmos de aprendizaje automático, basado en sonidos de la voz, de respiración y de tos.
• Los resultados muestran que la combinación de respiración y tos pueden predecir la Covid-19 con casi un 80% de exactitud.

En la web de la Comisión Europea puede encontrar un listado de todos los proyectos financiados para la lucha contra la Covid-19:

• COVID-19 In Vitro Diagnostic Devices and Test Methods Database

• Pruebas de detección